果蝇肠道干细胞对细胞内活性氧环境呈依赖性反应

撰文│杨雪琴

编辑│毕紫娟

审校│汤红明

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【据《Redox Biology》2021年2月报道】题：果蝇肠道干细胞对细胞内活性氧环境呈依赖性反应（作者杨宇丰等）（））

活性氧（ROS）参与细胞氧化还原反应，涉及广泛的生理和病理情况。适度增加ROS可促进细胞增殖和分化，而过量ROS引起脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤。ROS被认为在调节干细胞稳态中起关键作用，一些自我更新的组织中低浓度ROS正成为干性和多能性的关键条件。然而ROS 水平对干细胞的生存和增殖的微妙有益范围仍然难以捉摸。

成年果蝇中肠与哺乳动物消化系统在基因调控和细胞组成方面具有相似性，有利于干细胞行为、组织稳态、衰老和癌症的研究。果蝇中肠由肠干细胞（ISCs）维持，可生成肠前体细胞（EBs），然后分化为肠细胞（ECs）或肠内分泌细胞（EEs）。果蝇肠道上皮的建立和维持需要严格控制ISC的增殖和分化，这种细胞稳态的破坏会导致肠道功能异常，如肿瘤生长。这些特性提供了一个独特的机会来研究ROS在生理和病理条件下的作用。福州大学生命科学研究所的杨宇丰课题组发现果蝇肠道干细胞对细胞内活性氧环境呈依赖性反应，该成果发表在2021年2月的Redox Biology上。

肿瘤转移是癌症患者死亡的主要原因，也是抗癌策略的关键目标，它是一个复杂的过程，包括EMT、迁移、肿瘤细胞入侵和肿瘤周围区域的血管生成。与正常细胞相比，癌细胞中氧化状态升高，容易引起致癌，然而不同的内源性ROS水平对肿瘤细胞的影响知之甚少。近年来，ROS在肿瘤转移中的作用受到关注，癌细胞中ROS应激增加在获得上皮-间充质过渡和转化中起关键作用。但不同癌症进展阶段的ROS水平很大程度上仍然未知，准确了解氧化还原变化可能有助于抗癌。

Notch（N）在ISCs谱系分化中至关重要，干扰N会导致ISC样细胞积累，最终发展为肿瘤样肿块。课题组通过抑制Notch信号生成ISC肿瘤模型，观察肿瘤的形成，其中ISCs的细胞内ROS水平中度升高。在该模型中，异位提供氧化清除酶可限制肿瘤生长，表明ISCs的细胞内氧化还原平衡影响干细胞增殖率。与EMT和转移相关的基因包括整合素，是主要的细胞黏附受体，几乎参与了原发性肿瘤到转移的每个过程，肿瘤中经常检测到整合素表达改变。在果蝇肠道中，β PS整合素亚基（mys）对ISCs的维持和增殖至关重要。发现与敲低N的ISCs一样，敲低mys的ISCs也有类似的ROS水平中度升高，伴随ISCs丢失。课题组敲低N和mys来模拟ECM缺失的肿瘤模型，没有ECM而存活的肿瘤细胞表现出极高的ROS水平，抗氧化处理提高了存活率。

图1 不同条件下ISCs中ROS水平及调节概括

为了量化ISCs的ROS水平，使用DHE测量细胞内ROS水平。与临近分化的ECs相比，ISCs的ROS 水平明显较低，超氧化物水平也较低。检测ISCs的低水平ROS是否由Nrf2/CncC调控，发现CncC靶基因gstD1在ISCs中高表达，因此CncC在ISCs 中似乎被要求维持ROS 水平。野生型果蝇中发现年龄相关的ROS水平升高和上皮稳态丢失，ISCs 在衰老果蝇中过度增殖。检测肠上皮内ISCs的增殖率，发现21天成虫ISCs的ROS水平和增殖率高于7天成虫，说明肠上皮的退化随着年龄增长而加剧。综上，表明ISCs的ROS水平保持在较低水平，随年龄增长而升高。

低浓度细胞内ROS被认为对干细胞的干性和多能性至关重要，接着检测ROS的变化是否影响ISCs稳态。利用TARGET系统在空间和时间上调节ISCs的ROS水平。在esg⁺细胞中特异性表达UAS-CncC 、UAS-Catalase或UAS-SOD2转基因来过表达ROS清除酶，未发现细胞的ROS水平降低，ISCs数量和表型与野生型相似。表明生理条件下ISCs的ROS水平可能很低，进一步降低很难。通过UAS-CncC^RNAi、UAS-Catalase^RNAi或UAS-SOD2^RNAi转基因敲低CncC、Catalase 和SOD2，ISCs的ROS水平显著上调，但ISCs的数量和表型仍然与野生型相似，表明生理状态下ISCs中ROS水平波动几乎不会破坏其内在稳态。

有研究提出ROS参与肿瘤的进展，与正常细胞相比，癌细胞生成更多的ROS。为了验证氧化还原调控在肿瘤发展中的作用，课题组构建了敲低N引起的肿瘤样病理模型，ISCs中N^RNAi 被诱导，所有肠道均能发展成肿瘤样表型。肿瘤样ISCs的ROS水平显著升高，伴随增殖率逐渐升高，提示癌细胞的ROS应激增加可能进一步促进ISCs的增殖和肿瘤形成。表明敲低notch导致N^RNAi ISC样肿瘤模型和ROS水平升高。然后检查在转移阶段是否相似。附着于ECM是正常上皮细胞生存和增殖所必需的，而肿瘤细胞在转移早期通常从基质转移。首先观察ISCs的基质附着情况，ISCs维持需要整合素介导的细胞黏附，利用TARGET系统敲低ISCs的mys，形成ECM缺失的模型，发现ISC表型缺失。检测仍然存活的ISCs，发现ROS水平中度升高，与N^RNAiISC 肿瘤相似。接着敲低ISCs的N和mys建立ECM缺失的肿瘤模型，模拟转移性肿瘤起始细胞。观察到严重的ISC表型缺失，而存活的ISCs中ROS水平显著增加。综上，表明敲低β-整合素，导致ISC 表型缺失和ROS水平升高。

肿瘤样ISCs（N^RNAi）和ECM缺失的ISCs（mys ^RNAi）中发现相似的ROS水平中度升高，探索相似之下是否有差异。N^RNAi背景下CncC、Catalase或SOD2过表达时，肿瘤形成明显被阻止；而CncC、Catalase 或SOD2沉默后，ROS 水平升高，CncC^RNAi或SOD2^RNAi下ISCs增多，Catalase^RNAi下甚至出现小的肿瘤样簇。综上，表明ROS的增加加重了N^RNAi肿瘤中ISCs过度增殖和肿瘤形成。为了探索mys^RNAi引起的ROS水平中等升高是否导致ISCs丢失，mys^RNAi果蝇中下调ROS水平，发现加重ISCs表型丢失，而上调ROS水平则部分抑制ISCs丢失，表明ROS在ECM缺失的ISCs中具有促进存活的能力。但在ECM缺失的肿瘤模型中降低ROS可防止ISCs丢失，说明过量的ROS可能对细胞有毒，而抗氧化剂清除过多的ROS可能促进肿瘤起始细胞生存，提高恶性程度。推测在ECM缺失的肿瘤模型中，ROS过度积累超过了细胞耐受阈值，是导致ISCs表型丢失的主要原因。

组织稳态通过多能体细胞的分裂和分化来调控，多能体细胞会产生特定组织的不同细胞类型。这些过程需要精确调节ROS水平，本研究使用果蝇ISCs作为体内模型来解决这一问题。与分化细胞相比，ISCs的ROS水平较低，随年龄增长而增加。上调或下调ROS水平均不会显著影响ISCs，表明ISCs存在一个内稳态范围。癌细胞中ROS水平增加，反映了氧化还原稳态的破坏。敲低N的肿瘤样ISCs和敲低mys的ECM缺失的ISCs，观察到相似的ROS水平中度升高。ROS水平升高促进肿瘤样ISCs增殖，降低则抑制过度增殖；进一步增加ROS促进ECM缺失的ISCs存活，而减少ROS则加剧ECM缺失的ISCs丢失。ROS应激的增加可能有助于肿瘤起始细胞增殖和肿瘤形成，调节ROS可能成为Notch相关癌症的潜在治疗手段。N和mys缺失的ISCs类似于转移性肿瘤细胞，ROS水平更高，细胞丢失更严重，异位提供抗氧化酶可部分阻止，意味着ISCs存在一个微妙的促存活和增殖的ROS水平范围。

综上所述，本研究表明细胞内ROS水平是不同条件下干细胞和肿瘤细胞命运的关键决定因素，建议针对干细胞和肿瘤的抗氧化干预应根据具体情况谨慎制定。

（ ID：yxckbsc2021050801）

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